Les Centres Nationaux de Référence (CNR) sont des laboratoires experts dans la microbiologie des maladies transmissibles. Ils sont nommés par arrêté du Ministère en charge de la santé pour une période de 4 ans. Leur reconduction est soumise à une évaluation faite par un Comité des CNR placé sous la responsabilité du Directeur général de l’Institut de Veille Sanitaire.

Il est chargé, en liaison étroite avec l’Institut National de Veille Sanitaire (InVS) de contribuer au diagnostic et à la surveillance épidémiologique des infections humaines causées par le virus de la rougeole (Measles virus, MeV, virus morbilleux), le virus respiratoire syncytial humain (hRSV, VRS), le métapneumovirus humain (hMPV), les 4 virus parainfluenza humain (hPIV) et le virus des oreillons (MuV, virus ourlien).

Le diagnostic virologique de la rougeole accompagne en général le processus de « D.O. » (Déclaration Obligatoire de la Rougeole). Il s’appuie soit sur le diagnostic direct : recherche du virus ou de ses constituants (ARN, antigènes), soit sur la recherche des anticorps : diagnostic indirect ou sérodiagnostic.

Les prélèvements :

• Le prélèvement salivaire est réalisé par le médecin à l’aide d’un kit salivaire fourni par les ARS, comprenant les systèmes de prélèvement (« salivette »), de transport (boite et enveloppe), et de renseignements (identité clinique). Le prélèvement permet la recherche du génome ARN viral et des anticorps anti virus en cas d’ARN négatif. Il est transmis par voie postale au CNR.
• En milieu hospitalier un prélèvement nasal ou naso-pharyngé sur milieu de transport virologique est recommandé. Il permet de rechercher l’ARN viral.
• Le prélèvement sanguin est destiné le plus souvent à la recherche des anticorps anti virus de la rougeole (sérologie). C’est aujourd’hui l’approche recommandée en médecine communautaire (Cf. Fiche de recommandations). La prise de sang périphérique est réalisée sur un tube sec. Il n’est pas nécessaire si un prélèvement salivaire a été réalisé. La présence du virus dans le sang (virémie) peut être recherchée sur un tube de sang EDTA.
• Dans certaines complications, d’autres prélèvements sont utiles : secrétions trachéo-bronchiques, urines, liquide céphalo-rachidien…

Les techniques :

• La technique de base utilisée pour la détection du virus est la recherche de l’ARN viral par une technique moléculaire : RT-PCR (reverse-transcription, polymerase-chain-reaction) en temps réel. En cas de détection positive, l’identification du génotype viral est effectuée par séquençage d’une partie du génome viral.
• L’isolement des souches de virus de la rougeole est réalisé au CNR sur des cultures de cellules Vero Slam. Il est indiqué pour l’étude de certaines souches virales.
• La détection des anticorps anti virus de la rougeole, des classes IgG et IgM, est réalisée en routine à l’aide de trousses immunoenzymatiques (ELISA) commerciales. La recherche des anticorps neutralisants en culture cellulaire (anticorps protecteurs) est possible, mais plus compliquée. A partir d’un certain taux, ils sont corrélés aux taux d’anticorps décelés en ELISA.

Les délais de réponse, interprétation et transmission des résultats :

• L’ARN viral est détectable en environ 4-5 heures par la technique de RT-PCR. Il signe l’infection virale en cours. Dans la salive ou le naso-pharynx, il est présent pendant les phases d’invasion et éruptive. La détection dans le sang (virémie) est précoce et transitoire. La présence du virus dans l’urine peut être prolongée de quelques jours.
• L’isolement du virus en culture nécessite au minimum une semaine de culture.
• Les anticorps anti virus de la rougeole sont dosables en ELISA en environ 2 heures. La présence d’anticorps IgM et IgG signe l’infection (en dehors d’une vaccination anti-rougeole récente). Les anticorps IgM et IgG apparaissent avec l’éruption ; les IgM persistent environ 2 mois, et les IgG très longtemps…
• Tout transport de plus de 72h à température ambiante des échantillons vers le CNR peut rendre faussement négatifs les tests de détection de l’ARN, du virus ou des anticorps IgM.

Les résultats des examens pratiqués au CNR sont transmis aussitôt au médecin ou biologiste prescripteurs, qui dans le cadre de la D.O., doivent les transmettrent à l’ARS locale.

Pour tous les virus (VRS, hMPV, hPIV , MuV, NDV), le prélèvement recommandé est un recueil de secrétions nasales :

• Elles sont prélevées par un écouvillonnage appuyé de la partie antérieure des fosses nasales ou par aspiration à l’aide d’une pompe. Elles doivent être placées dans un milieu spécifique (Milieu de Transport Virologique) et transmises au CNR.
•   D’autres prélèvements sont utilisables : secrétions trachéo-bronchiques chez les patients intubés, LCR : oreillons.
• Le prélèvement sanguin est inutile dans les infections à VRS, hMPV, hPIV, NDV (il n’y a pas de virémie et les anticorps spécifiques apparaissent de façon retardée). Il est utile dans les oreillons : détection des IgM et IgG par ELISA en cas de primoinfection.

    Les techniques mises en œuvre pour la recherche directe :

• La détection d’antigènes de VRS, hMPV et hPIV1,2 et 3 est réalisée par immunofluorescence sur un frottis de secrétions nasales.
• L’isolement viral est possible sur cellules MRC5 pour le VRS, et sur certaines lignées continues humaines ou animales pour les hPIV, hMPV et MuV. Cette technique n’est pas recommandée pour le diagnostic.
• La recherche de l’ARN viral est effectuée par RT-PCR pour tous les virus : VRS, hPIV, hMPV, MuV, NDV. Ce sont, selon les cas, des RT-PCR en temps réel ou classiques, uni- ou multiplex.

    Les délais de réponse, interprétation et transmission des résultats :

• Le test d’immunofluorescence directe fournit un résultat en environ 60 min. Il peut apparaître négatif si le prélèvement a été pratiqué tardivement, s’il contient peu de cellules, ou a été transmis dans de mauvaises conditions.
• L’ARN viral est détectable en environ 4-5 heures par la technique de RT-PCR, et 24 heures par la technique de RT-PCR classique. Il signe l’infection virale en cours. Pour tous les virus, il est toujours présent pendant la phase aiguë de la maladie et peut persister plusieurs jours après la guérison.

Les résultats des examens pratiqués au CNR sont transmis directement au médecin ou biologiste prescripteurs.

• Le CNR contribue à la connaissance de la séroprévalence et du niveau de protection de la population contre les virus de la rougeole, des oreillons, les VRS, hHMPV, hPIV et NDV par des enquêtes sérologiques.
• Le CNR assure le traçage épidémiologique d’infections liées à ces différents virus survenues des communautés (identification du cas index, épidémies nosocomiales des services hospitaliers, épidémies dans les collectivités de personnes âgées,etc…) grâce à l’utilisation d’outils moléculaires spécifiques.
• Le CNR constitue et entretient une souchothèque comprenant les souches de référence, les souches représentatives des épidémies successives et des souches isolées de pathologies graves ou particulières.

• Le CNR assure le maintien et la diffusion de matériel biologique de référence : souches virales, lignées cellulaires, contrôle ARN positifs.
• Il est investit dans la mise au point, l’évaluation et la diffusion des techniques de diagnostic, commerciales ou académiques.
• Il participe aux enseignements universitaires et hospitaliers sur les virus de la rougeole, des oreillons, les VRS, hMPV et hPIV.
• Il contribue à la formation de biologistes étrangers en les accueillant en stage ou en y associant le transfert des technologies.

Le CNR fait partie des laboratoires européens accrédités pour le diagnostic de la rougeole « Euro Measles/Rubella laboratory Network », par l’OMS.

Le CNR a mis en place une collaboration régulière avec trois structures :

• InVS : envoi bi-mensuel des informations épidémiologiques : nombre de souches, génotypes.
• « European Regional Reference laboratory for Measles and rubella », à l’Institut d’Immunologie (Luxembourg) : envoi des séquences virales pour comparaison aux autres génotypes européens.
• « WHO Regional Office for Europe, Communicable Disease Unit » de Copenhague : envoi des informations épidémiologiques.

Le CNR, localisé dans le Laboratoire de Virologie Humaine et Moléculaire du CHU Caen Normandie est ouvert du lundi au vendredi de 8h à 17h. Les échantillons peuvent être reçus le samedi matin de 8h à 12h.

Les recherches d’ARN viral sont effectuées tous les jours ouvrables.

La fiche accompagnant l’échantillon doit comprendre, outre les renseignements administratifs (nom, prenom, âge, sexe,…etc.), les informations suivantes :

• le nom, l’adresse, le N° de téléphone et le courriel du médecin prescripteur,
• la date du début de l’éruption et la date de réalisation du prélèvement salivaire,
• une appréciation globale de l’intensité de la maladie : rougeole typique, rougeole atténuée, rougeole compliquée,
• le terrain fragilisé : nourrissons, femmes enceintes, immunodéprimés,
• la notion d’une vaccination dans l’enfance (1 ou 2 doses) ou récente (1 à 4 semaines), ou d’un voyage récent,
• l’existence ou non de cas groupés et/ou d’un contact identifié,
• le résultat peut être attendu dans les 24-48h. suivant la réception de l’échantillon. Il est envoyé aussitôt par fax ou courriel au médecin ou au laboratoire prescripteurs. Un envoi postal, comprenant le génotype viral en cas de recherche d’ARN positive, suit quelques jours après,
• l’identification du génotype viral par séquençage est réalisée 2 fois par semaine.