Centro Nacional de Referencia para los Virus del Sarampión, la Rubéola y las Paperas

Los Centros Nacionales de Referencia ()son CNR laboratorios especializados en la microbiología de las enfermedades transmisibles . Son designados por decreto del Ministerio de Salud por un período de cuatro años. Su renovación está sujeta a la evaluación de un Comité de CNR bajo la responsabilidad del Director General del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (InVS).

Es responsable, en estrecha colaboración con Salud Pública de Francia (SpF), de contribuir al diagnóstico y la vigilancia epidemiológica de las infecciones humanas causadas por el virus del sarampión (virus del sarampión, MeV), el virus respiratorio sincitial humano (VRSh, RSV), el metapneumovirus humano (hMPV), los 4 virus de la parainfluenza humana (hPIV) y el virus de las paperas (MuV, virus de las paperas).

El diagnóstico virológico del sarampión generalmente acompaña al proceso de notificación obligatoria de casos de sarampión. Se basa en el diagnóstico directo (detección del virus o sus componentes, como ARN y antígenos) o en la detección de anticuerpos (diagnóstico indirecto o serodiagnóstico).

Las muestras:

• La muestra de saliva es recolectada por el médico utilizando un kit proporcionado por las ARS), que incluye el sistema de recolección (salivatte), el contenedor de transporte (caja y sobre) y la información (identificación clínica). La muestra permite la detección del genoma de ARN viral y anticuerpos antivirales en casos de ARN negativo. Posteriormente, se envía por correo al Centro Nacional de Referencia (CNR).
• En un entorno hospitalario, se recomienda un hisopado nasal o nasofaríngeo en medio de transporte virológico. Esto permite la detección del ARN viral.
• La toma de muestras de sangre se utiliza con mayor frecuencia para detectar anticuerpos contra el virus del sarampión (serología). Este es el método recomendado actualmente en medicina comunitaria (véase la Hoja de Recomendaciones). La sangre periférica se recoge en un tubo seco. Esto no es necesario si ya se ha tomado una muestra de saliva. La presencia del virus en la sangre (viremia) puede detectarse en un tubo de sangre con EDTA.
• En determinadas complicaciones son útiles otras muestras: secreciones traqueobronquiales, orina, líquido cefalorraquídeo…

Las técnicas:

• La técnica básica para la detección de virus consiste en la búsqueda de ARN viral mediante una técnica molecular: la PCR en tiempo real (RT-PCR , por sus siglas en inglés). En caso de detección positiva, se identifica el genotipo viral mediante la secuenciación de una porción del genoma viral.
• En el CNR se realiza el aislamiento de cepas del virus del sarampión en cultivos de células Vero Slam. Este método está indicado para el estudio de determinadas cepas virales.
• La detección de anticuerpos contra el virus del sarampión, de las clases IgG e IgM, se realiza rutinariamente mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) comerciales. La detección de anticuerpos neutralizantes en cultivos celulares (anticuerpos protectores) es posible, pero más compleja. Por encima de cierto nivel, estos se correlacionan con los niveles de anticuerpos detectados mediante ELISA.

Tiempos de respuesta, interpretación y transmisión de resultados:

• El ARN viral se detecta aproximadamente en 4-5 horas mediante RT-PCR. Esto indica una infección viral activa. Está presente en la saliva o la nasofaringe durante las fases de invasión y erupción. Su detección en sangre (viremia) es temprana y transitoria. La presencia del virus en la orina puede persistir durante algunos días.
• Para aislar el virus en cultivo se requiere un mínimo de una semana de cultivo.
• Los anticuerpos contra el virus del sarampión pueden medirse mediante ELISA en aproximadamente 2 horas. La presencia de anticuerpos IgM e IgG indica infección (excepto en casos de vacunación reciente contra el sarampión). Los anticuerpos IgM e IgG aparecen con la erupción cutánea; los anticuerpos IgM persisten durante aproximadamente 2 meses, y los anticuerpos IgG durante mucho más tiempo
• El transporte de muestras al CNR puede provocar resultados falsos negativos en las pruebas de detección de ARN, virus o anticuerpos IgM.

Los resultados de las pruebas realizadas en el CNR se transmiten inmediatamente al médico o biólogo que las prescribe, quien, en el marco de la DO, debe transmitirlas alARS local

Para todos los virus (VSR, hMPV, hPIV, MuV, NDV), la muestra recomendada es una recolección de secreciones nasales:

• Se recogen mediante un hisopado firme de la parte anterior de las fosas nasales o mediante aspiración con una bomba. Deben colocarse en un medio específico (Medio de Transporte Virológico) y enviarse al CNR.
•   Se pueden utilizar otras muestras: secreciones traqueobronquiales en pacientes intubados, LCR: paperas.
• las infecciones por RSV(no hay viremia y los anticuerpos específicos aparecen con cierto retraso). Es útil en las paperas: detección de anticuerpos IgM e IgG mediante ELISA en casos de infección primaria.

    Las técnicas utilizadas para la búsqueda directa:

• La detección de RSV, hMPV y hPIV1,2 y 3 se realiza mediante inmunofluorescencia en una muestra de secreciones nasales.
• Es posible aislar el virus sincitial respiratorio (VSR) en células MRC5, y el virus de la influenza humana(hPIV), el virus del papiloma humano (hMPV) y el virus mucoepidermoide (MuV) en ciertas líneas celulares continuas humanas o animales. Esta técnica no se recomienda para el diagnóstico.
• La detección de ARN viral se realiza mediante RT-PCR para todos los virus: RSV, hPIV, hMPV, MuV y NDV. Según el caso, se tratade pruebas de RT-PCR en tiempo real o convencionales

    Tiempos de respuesta, interpretación y transmisión de resultados:

• La prueba de inmunofluorescencia directa proporciona un resultado en aproximadamente 60 minutos. Puede ser negativa si la muestra se tomó tarde, si contiene pocas células o si se transmitió en malas condiciones.
• El ARN viral se detecta aproximadamente en 4-5 horas mediante RT-PCRy en 24 horas mediante RT-PCR . Indica una infección viral activa. En todos los virus, siempre está presente durante la fase aguda de la enfermedad y puede persistir durante varios días después de la recuperación.

Los resultados de las pruebas realizadas en el CNR se transmiten directamente al médico o biólogo que las prescribe.

• El CNR los virus el VSRmediante estudios serológicos.
• El CNR garantiza el seguimiento epidemiológico de las infecciones vinculadas a estos diferentes virus que se producen en las comunidades (identificación del caso índice, epidemias nosocomiales en servicios hospitalarios, epidemias en comunidades de personas mayores, etc.) mediante el uso de herramientas moleculares específicas.
• El CNR establece y mantiene una biblioteca de cepas que incluye cepas de referencia, cepas representativas de epidemias sucesivas y cepas aisladas de patologías graves o particulares.

• El CNR garantiza el mantenimiento y la difusión del material biológico de referencia: cepas virales, líneas celulares, controles positivos de ARN.
• Está involucrado en el desarrollo, evaluación y difusión de técnicas de diagnóstico, tanto comerciales como académicas.
• Participa en docencia universitaria y hospitalaria sobre los virus del sarampión, paperas, VSR, hMPV y hPIV.
• Contribuye a la formación de biólogos extranjeros acogiéndolos para realizar prácticas o asociándolos a la transferencia de tecnologías.

El CNR forma parte de la red de laboratorios europeos acreditados para el diagnóstico del sarampión, denominada "Red Europea de Laboratorios de Sarampión y Rubéola", por laOMS.

El CNR ha establecido una colaboración regular con tres organizaciones:

• InVS : envío bimensual de información epidemiológica: número de cepas, genotipos.
• “Laboratorio Regional Europeo de Referencia para el Sarampión y la Rubéola”, en el Instituto de Inmunología (Luxemburgo): envío de secuencias virales para su comparación con otros genotipos europeos.
• “Oficina Regional de la OMS para Europa, Unidad de Enfermedades Transmisibles” en Copenhague: envío de información epidemiológica.

El Centro Nacional de Referencia (CNR), ubicado en el Laboratorio de Virología Humana y Molecular del Hospital Universitario de Caen Normandía, está abierto de lunes a viernes de 8:00 a 17:00.Las muestras se pueden recibir los sábados por la mañana de 8:00 a 12:00.

Las pruebas de ARN viral se realizan todos los días laborables.

La hoja informativa que acompaña a la muestra debe incluir, además de la información administrativa (apellidos, nombre, edad, sexo, etc.), la siguiente información:

• el nombre, la dirección, el número de teléfono y la dirección de correo electrónico del médico prescriptor,
• la fecha en que comenzó la erupción y la fecha en que se tomó la muestra de saliva,
• una evaluación general de la gravedad de la enfermedad: sarampión típico, sarampión leve, sarampión complicado,
• Población vulnerable: lactantes, mujeres embarazadas, personas inmunodeprimidas,
• la noción de vacunación infantil (1 o 2 dosis) o vacunación reciente (1 a 4 semanas), o viaje reciente,
• la existencia o no de casos agrupados y/o de un contacto identificado,
• El resultado se puede esperar en un plazo de 24 a 48 horas tras recibir la muestra. Se envía inmediatamente por fax o correo electrónico al médico o al laboratorio que la recetó. Unos días después, se realiza un envío postal, que incluye el genotipo viral en caso de una prueba de ARN positiva
• La identificación del genotipo viral mediante secuenciación se realiza dos veces por semana.