Type de tube :

• SST (sec à gel, bouchon doré)
• Sec sans gel (bouchon rouge)

Technique :

• Centrifugation (2000g, 10 minutes)
• Récupération de surnageant
• Aliquotage

Conservation :

• -80°C

Type de tube :

• EDTA (bouchon mauve)
• Citrate (bouchon bleu)
• Héparine (bouchon vert foncé)
• Héparine à gel (bouchon vert clair)

Technique :

• Centrifugation (2300g 11 minutes)
• Récupération du surnageant
• Aliquotage

Conservation :

• -80°C

Type de tube :

• Type de tube : EDTA

Technique :

• Centrifugation (1800g pendant 15 minutes à 4°C)
• Eliminer le plasma (Laisser 5mm de plasma au-dessus du culot)
• Récupérer l'anneau de cellules blanches (buffy coat) en aspirant 0.9mL maximum.
• Aliquoter le buffy coat dans un cryotube

Conservation :

• -80°C

Type de tube :

• Type de tube : EDTA

Matériels spécifiques :

• tubes Leucosep + compteur de cellules

Réactifs :

• PBS + milieu de conservation (DMSO – SVF)

Technique (pour 4 tubes EDTA de départ) :

1. Séparation des PBMC
   • Reprendre les tubes de prélèvement dépourvus de plasma, et ajouter du PBS stérile jusqu'au repère, puis re-suspendre délicatement les culots de cellules (Mesurer le volume de PBS ajouté)
   • Transvaser les suspensions cellulaires dans deux tubes FalconTM de 50ml, puis la diluer avec le même volume de PBS stérile
   • Rincer le tube de prélèvement avec du PBS pour récupérer le maximum de sang
   • Partager le volume total de sang dilué des deux tubes FalconTM (environ 80 ml) dans 3 tubes LeucoSepTM de 50 ml (milieu de séparation lymphocytes, MSL)
   • Centrifuger les tubes à 1000 g à température ambiante pendant 20 minutes sans frein
   • Pour chaque tube LeucoSepTM : Récupérer l'anneau de cellules mononuclées à l'interface du milieu de séparation et du surnageant (cf. figure : Aspect du tube Leucosep après centrifugation) à l'aide d'une pipette en se plaçant à la surface de l'anneau (il vaut mieux prendre du surnageant que du milieu de séparation), puis le déposer dans un tube de 15 ml stérile.
2. Lavage
   • Compléter avec du PBS (qsp 15 ml) et centrifuger les tubes de 15 ml à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante
   • Eliminer le surnageant, vortexer les tubes et pooler les culots dans un seul tube de 15 ml. Rincer les tubes avec 2mL de PBS pour récupérer le maximum de cellules et ajuster le volume final à 4mL avec du PBS
3. Numération
   • Prélever 400µL et compter les cellules par un compteur automatique (hématologie)
4. Lavage
   • Après le comptage, procéder à un deuxième lavage : Compléter le volume du tube avec du PBS (qsp 15mL) et centrifuger à 200g pendant 10 minutes.
   • Eliminer le surnageant à l'aide d'une pipette stérile, puis vortexer le culot cellulaire dans son volume mort, et placer le tube sur glace.
5. Ajustement de la concentration en PBMC.
   Pour les étapes suivantes, travailler sur glace jusqu'à la congélation des PBMC :
   • Préparer 11 cryotubes de 2 ml. Reprendre le culot de PBMC dans du milieu de congélation froid (4°C) (CryoStor® CS10, ou une solution de DMSO 10%-SVF 20%) en agitant délicatement le tube à la main.
     Note : Ajuster le volume de milieu de congélation de façon à obtenir une concentration entre 10 et 20 millions de cellules/ml (La quantité totale de PBMC attendue est de 40-60 millions de PBMC pour 40ml de sang).
6. Aliquotage
   • Répartir la suspension cellulaire en aliquots de 500μl dans des cryotubes pré-préparés (les PBMC doivent être congelés à raison de 5 à 10 millions de cellules par tube)
   • Fermer les tubes et replacer-les sur glace.

Conservation :

• -80°C

Type de tube :

• Type de tube : EDTA

Matériels spécifiques :

• tube Leucosep

Réactif :

• PBS

Technique (pour 1 tube EDTA) :

1. Séparation des PBMC
   • Transvaser le sang dans un tube Falcon de 12mL et diluer-le de 50% en ajoutant le même volume de PBS. Rincer le tube de prélèvement avec du PBS pour récupérer le maximum de sang.
   • Transvaser le sang dilué dans 1 tube LeucoSepTM de 15 ml (milieu de séparation des lymphocytes).
   • Centrifuger le tube à 1000 g à température ambiante pendant 20 minutes sans frein.
   • Récupérer l'anneau de cellules mononuclées à l'interface du milieu de séparation des lymphocytes et du surnageant à l'aide d'une pipette en se plaçant à la surface de l'anneau (il vaut mieux prendre du surnageant que du milieu de séparation). Déposer le dans un tube de 15 ml stérile. Compléter avec du PBS (qsp 15 ml)
2. Lavage
   • Centrifuger le tube de 15 ml à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante
   • Eliminer le surnageant, vortexer le tube et remettre le culot en suspension. Procéder à un 2ème lavage : compléter le tube avec du PBS (qsp 15 ml) et centrifuger à 200 g pendant 10 minutes.
   • Eliminer le surnageant à l'aide d'une pipette stérile, puis vortexer le culot cellulaire dans son volume mort, et placer le tube sur glace.
3. Aliquotage
   Pour les étapes suivantes, travailler sur glace jusqu'à la congélation des PBMC :
   • Préparer 2 cryotubes de 2 ml et les placer sur glace.
   • Répartir le culot de PBMC dans les 2 cryotubes.

Conservation :

• -80°C